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自然杀伤细胞（NK细胞）是机体天然免疫的主要细胞，在识别靶细胞上具有非特异性，通过与靶细胞表面的细胞间黏附分子-1（ICAM-1）的作用参与NK细胞的识别过程。自然杀伤（NK）细胞属于先天淋巴样细胞家族，其鉴定特征为不表达TCR和CD3分子，但表达神经细胞黏附分子（CD56）。这类细胞广泛分布于人类外周血、骨髓及多种组织中。此外，NK细胞还可通过表达自然细胞毒性受体1（NCR1，也称为NKp46或CD335）来鉴定，该受体与NK细胞的功能和激活密切相关[1]。
NK细胞的作用机制
NK细胞作为先天淋巴细胞，能够快速识别并杀伤肿瘤细胞和病毒感染的细胞，主要通过以下途径清除肿瘤：
颗粒胞吐作用：释放含有穿孔素和颗粒酶的颗粒，诱导肿瘤细胞凋亡。颗粒酶进入靶细胞并触发凋亡，而穿孔素在细胞膜上形成孔洞。
死亡受体介导的凋亡：分泌肿瘤坏死因子（TNF）家族成员（如FasL和TRAIL），与靶细胞上的受体结合并触发凋亡。
细胞因子和趋化因子的分泌：通过释放抗癌效应分子（如IFN-γ）诱导肿瘤细胞死亡。细胞因子如IL-2、IL-12、IL-15和IL-18可增强NK细胞的抗肿瘤效果。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）：NK细胞表达Fc受体（CD16），可与抗体的Fc区结合。CD16与免疫球蛋白包被的细胞结合后触发信号级联，导致抗体包被的细胞被杀伤[2]。
NK细胞的来源
由于NK细胞具有天然的肿瘤杀伤能力，且来源多样、移植物抗宿主病（GVHD）风险较低，近年来已成为癌症治疗的重要工具。NK细胞的主要来源包括外周血单核细胞（PBMCs）、脐带血（UCB）、诱导多能干细胞（iPSCs）体外分化[3]以及细胞系获得。
▶外周血NK细胞（PB-NK）
NK细胞可以相对容易地从患者（自体PB-NK）或健康供体（异体PB-NK）中分离出来，大多数临床前CAR-NK研究使用的是健康供体的PB-NK。自体NK细胞通常效果较差，原因是其功能可能被自身MHC抗原抑制，或由于患者疾病状态或前期治疗（如高强度化疗和放疗）导致淋巴细胞（包括NK细胞）的质量和数量受损，从而限制自体疗法的成功率。因此，异体PB-NK细胞通常是更优的选择。然而，由于外周血中NK细胞数量较少，需要大规模扩增才能满足治疗需求。虽然PB-NK细胞是成熟的细胞，无需长期分化过程，但它们仍面临转导效率低以及在长期培养中可能耗竭的问题[4-6]。
▶脐带血来源的NK细胞（CB-NK）
PB-NK细胞依赖供体来源，尤其是自体PB-NK，在紧急情况下可能受限，而脐带血（CB）NK细胞则具有现成可用和高产量的优势。例如，一小部分脐带血单位可在两周内扩增出超过10亿个NK细胞。此外，脐带血的单倍型可在采集时确定，从而能够建立HLA不匹配的细胞库。虽然CB-NK细胞某些细胞毒性受体的表达可能低于其他NK细胞，但它们在临床试验中仍显示出良好的前景，尤其是有研究表明，CB-NK细胞在体内具有长期存续的能力[7-10]。
▶干细胞来源的NK细胞（iNK）
利用人类诱导多能干细胞（iPSC）等干细胞分化NK细胞，可提供标准化、货架型的产品，减少供体间的变异性。尽管从干细胞制备NK细胞需要3-5周时间，比其他方法更长，但它能提供更一致的产品。iPSC来源的NK细胞已显示出抗肿瘤活性，并可用于生成CAR-NK细胞。然而，人们仍对其潜在的恶性转化风险、免疫原性以及细胞增殖对细胞因子的依赖性存在担忧[11-12]。
▶NK细胞系：NK-92
NK-92等NK细胞系简化了获取大量NK细胞的过程，因为它们易于培养和扩增。NK-92细胞源自淋巴瘤，具有强大的抗肿瘤活性，并能进行基因改造。然而，它们是肿瘤来源且非整倍体，因此在输注前需进行辐照以防止体内增殖，这限制了它们的持久性。临床试验表明，NK-92细胞安全且有效，但与原代NK细胞相比，其无法在体内增殖可能影响长期疗效[13]。欧洲等临床指导法规，仍对其使用作出了限制。
临床级别NK细胞扩增方法
临床级别NK细胞制备通常包括如下环节：细胞获取（分离/分化/复苏）、细胞大规模扩增、细胞洗涤、制剂分装、冻存/运输等[14]。
为达到临床所需的NK细胞数量，需要对NK细胞进行体外扩增以达到回输剂量，目前常用生物反应器对细胞进行体外扩增。NK细胞的体外扩增技术包含以下几个方面：
▶NK细胞的激活
细胞因子：常用IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等单独或组合激活NK细胞，短期激活虽不显著增加细胞数量，但能增强细胞毒性。
细胞裂解物：如CTV-1裂解物（CNDO-109）可短期激活NK细胞，临床试验中显示安全性。
▶NK细胞的扩增技术
滋养层细胞（Feeder Cells）：如基因改造的K562细胞系（表达mbIL-15/41BBL或mbIL-21/41BBL），可大幅扩增NK细胞，是目前临床最常用的方法。
无滋养层细胞：如血浆膜颗粒（PM particles）和抗体刺激（如抗CD3/CD52），提高了安全性和可扩展性。
其他平台：EBV-LCL细胞或自体PBMCs作为滋养层细胞，扩增效果显著但技术复杂度较高。
▶扩增设备
NK细胞可以在透气袋、细胞瓶或生物反应器中进行增殖。而根据各国监管部门的要求，临床级别的NK细胞制备需要满足符合GMP标准、全封闭、一次性耗材、生产记录可溯源等要求。
摆床生物反应器作为一种使用方便、工艺灵活且经济高效的生产方式，广泛应用于多个领域。其基于波浪式摇摆运动的培养袋设计，结合全自动系统监测和控制关键参数（如pO₂和pH）PID控制系统，在经过辐照的一次性细胞培养袋中进行细胞的批次、流加或灌流培养，减少了清洁验证的工作，显著降低了cGMP操作的成本，从而广泛应用于细胞治疗行业。相对于其他培养方式，摆床生物反应器在封闭性、规模化、工艺灵活性、自动化方面都具有显著优势。
摆床反应器进行细胞扩增案例
在带有10L托盘的SKC600摆床反应器上，配合2L一次性截留膜细胞培养袋进行培养。培养中使用到压缩空气、O2和CO2三路气体。本次培养以K562为滋养层细胞，接种密度为1×106 cells/mL，初始体积为1L，采用pH/DO模式进行培养，对pH和DO采取自动PID控制。
Day 1开启灌流。培养过程中转速为4-9rpm，摇摆角度为3-6°。每天根据细胞状态调整转速和角度。通过鲁尔注射器对上清进行取样，在血糖仪上分析葡萄糖浓度。糖耗越大，则表明细胞生长速率越大。根据所测定糖耗值决定灌流速度。培养至day 8，细胞密度到达2×107 cells/mL，停止灌流，下袋收获。
NK细胞大规模扩增中面临的挑战
在NK细胞生产或大规模扩增中，会面临以下问题：
▶细胞来源
原代NK细胞的获取和扩增：从外周血（PB）或脐带血（CB）中获取的原代NK细胞，其增殖能力可能较低，且存活时间较短，难以满足大规模生产的需要。而CB来源的NK细胞虽然增殖能力较强，但它们在表型和功能上较为幼稚，可能不如其他来源的NK细胞具有细胞毒性[14]。
iPSC来源NK细胞的分化和培养：虽然iPSC可以提供无限的NK细胞来源，但其分化为NK细胞的过程复杂且耗时，增加了生产成本和时间。此外，iPSC在长期培养过程中存在基因突变的风险，可能存在致癌风险，需要进行严格的基因检测和质量控制。
NK细胞系的使用限制：NK细胞系如NK-92等虽然易于基因修饰和扩增，但需要在输注前进行辐射处理，这可能会影响细胞的存活和细胞毒性。此外，NK细胞系在体内的持续性较差，通常在初次输注后两天内就会被清除，可能要面临需要多次回输[15,16]。
▶基因修饰
病毒载体的局限性：目前，NK细胞的基因导入主要依赖于慢病毒载体和逆转录病毒载体，然而，由于NK细胞固有的抗病毒活性，传统慢病毒在NK细胞层面的转导效率并不理想。此外，病毒载体的生产成本高、耗时长，且对于较大的CAR构建（如第三代、第四代和第五代CAR）的核酸携带能力有限。
非病毒基因修饰方法的效率和安全性：非病毒基因修饰方法如转座子系统和CRISPR技术虽然具有潜力，但目前还存在一些问题。转座子系统存在插入突变和免疫原性的风险，而CRISPR技术存在“脱靶”效应，可能导致不必要的突变。此外，非病毒基因修饰方法的转染效率通常低于病毒载体，需要进一步优化以提高效率和安全性[17]。
▶制备过程中的挑战
质量控制：大规模扩增NK细胞需要高效的扩增方法和严格的质量控制。目前，基于滋养层细胞的扩增方法虽然能够快速扩增NK细胞，但存在安全性和监管问题，如滋养层细胞残留的风险。而无滋养层细胞的扩增方法虽然避免了这些问题，但扩增效率较低。此外，NK细胞在扩增过程中可能会发生表型和功能的变化，需要进行严格的质量控制以确保细胞的活性和细胞毒性。其他如人工抗原提呈细胞（aAPCs）等方法的持续研究，也在推动NK细胞疗法进入临床实践起到作用。
细胞保存和运输：NK细胞在保存和运输过程中可能会受到损伤，影响其活性和细胞毒性。例如，冷冻保存可能会导致NK细胞的凋亡和功能下降，需要采取措施如添加保护剂或优化冷冻保存条件来减少损伤。此外，NK细胞的运输也需要在适当的条件下进行，以确保细胞的活性和稳定性[16]。
未来发展方向
NK细胞疗法的未来发展方向聚焦几个方向：
▶联合疗法优化
通过协同CAR-T细胞的特异性与NK细胞的天然细胞毒性，或联合单抗增强ADCC效应，可突破单一疗法局限。化疗药物可协同改善肿瘤微环境，提升NK细胞识别效率。
▶基因工程突破
CAR-NK凭借其HLA非依赖性特征，显著降低GVHD风险。CAR分子结构的升级以及递送难题的解决，有助于推动CAR-NK细胞的产业化。另外iPSC技术的进一步成熟，也将推动“现货型”CAR-NK产品开发，实现标准化大规模生产。
▶无滋养层技术革新
新型人工基质替代传统滋养细胞，通过稳定表达膜结合细胞因子，在确保扩增效率的同时消除残留风险，为GMP标准化生产提供解决方案。
参考文献
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